老年性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（RP）等视网膜变性疾病是目前尚无有效治疗手段的凶险致盲性眼病，也是公认的“视力杀手”。由中南大学爱尔眼科学院院长唐仕波教授、爱尔眼科研究所副所长陈建苏教授带领团队，利用诱导多能干细胞（iPS）条件培养基和飞秒角膜透镜，联合构建高活性视网膜色素上皮细胞（RPE）的研究，不但有利于对视网膜色素上皮细胞生理特性、药物筛选等研究，还有利于构建组织工程视网膜层及其移植。这将帮助科学家开发出应用组织工程RPE细胞片治疗视网膜变性疾病和光感受器病变的新方法。

培养高活性的视网膜细胞

与年龄相关的老年性黄斑变性是发达国家50岁以上人群视力损害和致盲的首要病因，多达90%的病人无法治愈。数据显示，发达国家年龄50岁以上黄斑变性的发病率达11%，目前我国的发病率接近发达国家，患病人数超过3000万人，并以每年30万人次的速度增加，成为我国现阶段50岁以上年龄群体发病率最高的三大眼科疾病之一，而且女性呈现出比男性更高的危险性。

研究发现，未来最有希望治疗老年性黄斑变性的方式是视网膜色素上皮细胞疗法、视网膜黄斑部分的移植。那么，要采用RPE疗法，就需要先培养健康的视网膜细胞。

陈建苏告诉科技日报记者，取出死亡时间在3小时内捐献者的带有部分脉络膜的视网膜组织，在解剖显微镜下可将带有部分脉络膜的RPE层从捐赠组织中分离出来，并培养出RPE细胞。“本研究通过半定量蛋白芯片分析鉴定，发现了包括血小板衍生生长因子AA（PDGF-AA）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP-2）等因子，在诱导多能干细胞上清液中，含量显著增高，从而获得大量增殖能力强、高活性及具有良好功能的RPE细胞。”

获得类似视网膜自然结构的片状组织

正常眼内的RPE细胞，是紧密连接的单层细胞，只有移植单层RPE细胞才有可能提高其存活率并发挥功能。基于这个原因，研究团队开始利用组织工程的方式，尝试体外构建具有功能的RPE细胞片。

基因整合是指把两个非同源基因连接起来。爱尔眼科团队针对视网膜变性疾病展开进一步的研究，从患者的尿液、血液提取体细胞，进行体外扩增培养，并通过非基因整合型的方式进行重编程转化，将患者的尿液、血液来源的细胞逆转为具有自我复制及分化能力的诱导多能干细胞。

“通过研究，对转化成功的尿液、血液来源的诱导多能干细胞，进行传代纯化并通过多能性基因表达、干性蛋白标志物免疫荧光及体外拟胚体试验等方法进行鉴定，确认产生的诱导多能干细胞具有多向分化的能力。”爱尔眼科学院助理研究员顾佳宁说，后续通过3D分化培养方式，用不同的培养基对诱导多能干细胞进行视网膜方向的定向诱导分化，获得视网膜器官发育的类似组织。并对其中出现色素表达的细胞，进行分离培养，得到RPE细胞，通过培养形成一层超薄的类似视网膜自然结构的片状组织。

“但目前尿液及血液细胞的各种重编程方法效率均不高，往往要观察半个月以上，才能确定是否重编程成功。因此，获得患者体细胞来源的iPS细胞并不容易。”陈建苏解释说，对iPS细胞的诱导分化存在多种影响因素，如初始细胞的密度及iPS细胞状态等。因此，通过iPS细胞诱导分化得到的RPE细胞色素表达情况不稳定，还需进一步控制各个变量，获得稳定分化成优质RPE细胞的诱导方法。

变角膜透镜为支架材料

一个成功的RPE细胞片应具备三要素，即种子细胞、培养系统和支架材料。除了高活性的种子细胞外，支架材料可有效保证细胞的黏附性，以及在移植时可确保细胞以正确的方向面对光感受器细胞。于是，研究团队把全飞秒激光近视手术中切下取出的角膜基质透镜“变废为宝”，提高了其再利用价值。研究发现，当RPE细胞接种在角膜基质透镜上，并应用诱导多能干细胞条件培养液培养，可以使RPE细胞片具有更多的干细胞特性、完善的纤毛组装以及成熟功能。

此外，团队还采用3D细胞培养、类器官等新技术，建立眼遗传病患者疾病细胞模型，探明眼病发病和发展的机制及规律。基于发病机理分析，对现有药物做出个体化评估，以及发现新的治疗靶点和筛选新药物，获得眼遗传病及其他眼病新的治疗方案。

“几十年来，干细胞一直有望治愈疑难杂症。该项研究将加速推动更安全的诱导多能干细胞疗法的发展，同时，实验已经证明了该项技术的安全性、有效性，为进行人体临床试验提供了充足依据。”唐仕波说。